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多肽成打开蛋白质大门钥匙 破解纳米孔测序的技术瓶颈

2021-09-15 11:38:08 来源:科技日报

蛋白质是构建生命体的基本物质之一,在合成、催化和信号传感等所有生命活动中均承担着重要的功能。开发一种可靠、高效的蛋白质测序技术对于理解生命过程、揭示疾病机理至关重要。作为构成蛋白质的组成片段——多肽成为打开蛋白质这扇大门的钥匙。

纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术,其中多肽纳米孔测序仍面临诸多挑战。科技日报记者9月12日从南京大学获悉,该校化学化工学院研究团队在国际知名期刊《纳米快报》杂志发表论文称,他们利用纳米孔错位测序技术,像在水井里提绳打水一样,构建了多肽-DNA嵌合链,用DNA测序酶与DNA的结合,通过DNA的移动,带动多肽分子在纳米孔内的棘轮运动,从而破解了对多肽进行纳米孔测序的技术瓶颈。

现有蛋白质测序技术有缺陷

蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要物质,可以说,没有蛋白质就没有生命。而蛋白质的功能是由蛋白质的序列决定的,序列的微小改变,可能导致蛋白质失去生物活性或者诱发疾病。

如果我们能为蛋白质测序,就可以确定蛋白质是否有序列变化,从而判断其是否会对人类健康产生影响。

“与核酸检测不同,目前蛋白质测序的难点在于,缺乏有效的序列扩增方法,技术发展上停滞不前,主要靠质谱法和埃德曼降解法来测序。”该论文的通讯作者、南京大学化学化工学院教授黄硕说。

通俗地说,质谱法是用生物酶将蛋白质分解成很多多肽片段,再通过质谱仪器检测,确定蛋白质片段的信息,最终将这些片段重构成蛋白质序列。而埃德曼降解法是用化学方法将蛋白质N端的一个氨基酸切下来进行鉴定,然后再进行第二轮的氨基酸切割和鉴定,多次循环操作后,确定氨基酸的序列。

但在黄硕看来,这两个方法都有局限性。“相较于DNA和RNA测序,构成蛋白质的氨基酸种类更多,质谱法的检测难度大于核酸测序。而对埃德曼降解法来说,它只能对单一的蛋白质样品序列解析,如果降解的样品纯度不够,混合有多种蛋白质样品,那么被切下来的氨基酸就会有很多种,就无法确定哪个氨基酸来自哪个蛋白质,从而无法判断蛋白质的序列。另外,还有一些肽段的末端是封闭的,就不能用降解法。”黄硕介绍。

更重要的是,由于无法实现序列扩增,现有蛋白质测序技术的灵敏度较低,这意味着无法检测自然界中一些丰度很低的蛋白质样品。黄硕认为,现有技术难以对复杂环境中的蛋白质直接测序,比如体液、土壤、水体中的蛋白质样品,要先做一些纯化、富集,达到测序的样品标准,才能在质谱仪中测序。同时,蛋白质的化学修饰很丰富,这也有可能干扰蛋白质测序。

DNA“牵手”多肽“穿行”纳米孔

能不能找到一种更微观的测序方式,只用一个分子就能为蛋白质测序?从2015年开始,纳米孔测序技术进入黄硕课题组研究视野。

纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术,已在DNA和RNA测序方面取得成功,它让单链的核酸穿过纳米孔,通过纳米孔内的检测器获得核酸链的碱基信息。

“如果能在单分子水平上为蛋白质测序,我们就能对低丰度蛋白和单细胞蛋白质组学进行更加灵敏的检测。”黄硕表示,他们课题组受此启发,开始研究如何用纳米孔技术,进行蛋白质或多肽的单分子测序。

但是纳米孔测序仍面临诸多挑战,其中一个主要的困难是如何实现多肽在纳米孔中可控的棘轮运动,而这主要缘于目前没有和肽链相匹配、有很强亲和力的多肽测序酶。

黄硕告诉记者:“棘轮运动指的是生物高分子贴着纳米孔的内壁,顺着同一个方向做匀速、定向运动,类似于附着在齿轮内壁上移动一样,这需要找到一种酶来控制多肽的运动速度。”

黄硕课题组在多轮尝试失败后提出纳米孔错位测序技术。“核酸的纳米孔识别位点和酶的反应位点,有一个固定的约14—15个碱基的错位,这就形成了一个测序窗口,可以利用这个不受酶反应限制的窗口,实现测序。”黄硕说。

纳米孔错位测序技术能否应用在多肽测序领域?在此次研究中,黄硕课题组将多肽和DNA嵌合成一条链条,嵌合链的DNA部分为“牵引链”,在检测过程中,DNA测序酶与DNA结合,通过拉动DNA部分,牵动整条链在纳米孔中的可控棘轮运动,实现多肽的纳米孔直接读取。

黄硕解释道:“这就相当于用绳子在井里提水桶,如果井是纳米孔的话,井绳就是DNA,水桶就是多肽。‘井口’的DNA测序酶拉动DNA在纳米孔内移动,而DNA又与多肽嵌合在一起,DNA的移动,也就直接拉动了多肽的移动,从而实现了多肽的纳米孔测序。”

黄硕介绍,经验证,多肽的纳米孔测序信号表现出高度的一致性和序列相关性,由单氨基酸替换引起的电流变化也能被清楚地检测到。通过将多肽的N端或C端与DNA驱动链进行偶联,实现了对多肽两端氨基酸序列信息的读取。

“这意味着,可以对蛋白质单分子进行测序,这为今后的蛋白质高通量测序及蛋白质重构,提供了一个全新的工具。”黄硕说,借助蛋白质序列研究,可以对蛋白质的功能进行预测,从而帮助理解、解释相关生命活动。(科技日报记者 金凤)

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